【10×单细胞应用解析】Science: 小鼠肾脏单细胞转录组测序揭示了肾脏疾病的潜在细胞靶标

文章信息

论文标题：Single-cell transcriptomics of the mouse kidney reveals potential cellular targets of kidney disease

刊登日期：2018年5月

发表杂志：Science

影响因子：41.058

研究机构：宾夕法尼亚大学、哥伦比亚大学

样本类型：小鼠全肾细胞

技术手段：单细胞测序（10X Chromium）、基因组重测序、RNA-seq、免疫荧光、模型鼠

前言

肾脏是一种高度复杂的器官，对人类健康具有至关重要的作用。肾脏可以去除血液中的氮，钠离子和其他废物，控制血液电解质和酸碱平衡，并分泌调节血液成分和血压的激素。肾脏由几个功能和解剖学上的不同部分组成。肾小球是一组特殊的毛细血管，可以过滤血液并产生由水和溶质（如钠，钾葡萄糖和碳酸氢钠）构成的原尿液。原尿液进入近端小管，流经中段细小管和远端小管，中段细小管将原尿液压力加大，同时中段细小管和远端小管将原尿液中的有用物质（大部分水、氨基酸、离子等）吸收，而没有吸收的尿酸和其他有机阴离子、钾和质子与少部分水形成尿液。亨利氏套主要参与调解溶质浓度。远端小管和收集管调解溶质运输，因此，每个部分对于维持电解质和水的稳态至关重要。

过去对肾细胞的类群注释是根据其功能，解剖位置或通过少量标记基因进行，但是这些细胞注释方法使得我们对肾细胞的理解是不完整的。为了帮助填补这一知识空白，作者使用单细胞转录组测序对来自健康小鼠肾脏的57,979个细胞进行了分析。 基于基因表达模式，作者推断由不同的基因突变引起但具有相似表型的遗传性肾病具有相同的起源细胞，在成年小鼠的肾集合管新发现一个新的细胞类型（过渡细胞）。拟时序分析和体内谱系示踪显示闰细胞（intercalated cells）和主细胞（principal cells）经历了由Notch信号介导的转变。在小鼠和人类肾脏疾病中，向主细胞的命运转移与代谢性酸中毒相关。

文章结果

1、细胞聚类

作者取七只健康雄性鼠（4只正常鼠，1只Ksp^CremT/mG鼠、1只Scl^CremT/mG鼠、1只Pod^CremT/mG鼠），取肾后制备成细胞悬浮液，对57979个细胞进行了测序，经过质控后，43745个细胞用于下游分析，所有细胞分成了16个细胞亚群，细胞亚群中细胞数量从24到26482不等（图1 A）。

2、定义细胞类群

为了定义每个细胞簇，作者通过差异基因表达分析分析簇特异性标记基因，例如内皮细胞的血管内皮生长因子受体2（Kdr），足细胞的Nephrin（Nphs1）和Podocin（Nphs2），远端亨利氏套的Slc12a1和远曲小管的Slc12a3（图1B）。另外鉴定了其他标记物，包括足细胞的Cdkn1c和Bcam。免疫细胞和内皮细胞簇与上皮细胞簇分离，但输尿管芽（簇6-8）和后肾间充质来源的上皮细胞簇（簇2-5）紧密排列。进一步分析确定发现簇1,3和7包含8个子簇（图1 C）， Cluster 1分为内皮细胞，周细胞/血管平滑肌/系膜样细胞和Henle细胞下行环（DLH）。 Cluster 3（近端小管）分为S1，S2和S3段或近曲段和直段。闰细胞（Cluster 7）分成A型和B型闰细胞。

图1

3、孟德尔病基因具有细胞类型特异性

虽然早期的研究表明内皮细胞和近端小管缺陷参与了蛋白尿的发生发展，而且这些细胞的功能和结构变化确实可以在蛋白尿患者中看到，但是29个与人类蛋白尿单基因遗传有关的基因中，有21个同源基因只在小鼠肾小球足细胞中表达，表明足细胞功能障碍是蛋白尿的主要原因。人类肾小管酸中毒(RTA)相关基因仅在收集管闰细胞表达，证实了这些细胞在酸碱平衡中的主要作用（图2 A）。

遵循相同的逻辑，发现与血压（BP）、慢性肾病（CKD）、血清代谢物水平、肾结石（例如Slc34a1）和肾小管酸中毒（例如Atp6v1b1）相关的假定复杂性状疾病基因大多数仅在单细胞类型中表达，例如集合管细胞（RTA）和近端小管细胞（肾结石）、与血浆代谢物水平相关的基因，例如Slc17a3（尿酸），Slc51a（胆汁酸）和Slc16a9（肉毒碱）以及CKD相关的基因，显示出近端小管特异性表达，而BP相关基因是主要在集合管细胞中表达（图2B）。

图2

4、鉴定肾集合管一种新的细胞类型

肾集合管与其他肾上皮细胞不同，它起源于输尿管芽而非肾后壁间质。肾集合管至少由三种不同的细胞类型组成：负责钠、水的再吸收和钾分泌的主细胞(PC，Aqp2⁺)，和负责酸和碱分泌的闰细胞(A-IC、B-IC，Atp6v1g3⁺)。在单细胞测序基础上鉴定到了同时表达PC、IC标记基因的新细胞类群（cluster 8）（图3 A、B），双重免疫荧光染色和原位杂交证实了这类细胞的存在（图3 C-F）。

拟时序分析发现新的细胞类型位于PC和IC之间（图3 G），表明cluster 8是一种过渡细胞（transitional cell）类型。这些结果表明，收集管不仅含有PC细胞和IC细胞，还含有第三种不同的过渡细胞类型。这就提出了一种可能性，即IC细胞和PC细胞位于细胞表型图谱的两端，这两种细胞经历了细胞转变。

图3

5、荧光谱系示踪证实了收集管细胞的可塑性

作者构建了在分化主细胞和闰细胞上带有谱系标签的小鼠（Aqp2^CremT/mG、Atp6^CremT/mG）中，结合GFP进行了三荧光标记，在Aqp2^CremT/mG GFP-阳性细胞中，61.6% 细胞AQP2阳性, 29.2%细胞ATP6V1B1阳性、9.2%细胞AQP2和ATP6V1B1双阳性。同时为了确定细胞增殖是否导致了这种细胞可塑性，作者计算了细胞周期调控基因在不同细胞亚群的表达，发现只有细胞簇9和16 (新细胞类型1和2)高表达细胞周期基因，表明cluster 8是一个过渡性细胞群，而不是增殖祖细胞。

图4

6、在Notch配体和受体相互作用下驱动收集管细胞的可塑性，导致慢性肾脏疾病出现异常细胞群

在PC和IC细胞转换过程中，PC高表达与细胞粘附、水稳态和盐转运相关的基因，而IC高表达与ATP水解/合成、质子耦合转运和氧化还原过程相关的基因，表明PC和IC细胞转换过程Notch信号通路被激活。Notch通过表达Notch配体或Notch受体来调控细胞特性，配体和受体的交替表达构成信号发送细胞(Notch-off)和信号接收细胞(Notch-on)。IC细胞高表达Notch配体基因(例如Jag1)而PC细胞高表达Notch受体基因（例如Hes1）（图5 A），免疫荧光也表明IC细胞中表达Jag1（图5 B）。

为了研究Notch信号是否驱动了ic-pc细胞的转化，作者构建了Pax8rtTA/TRENICD小鼠（图5 C），其可诱导表达Notch细胞内受体结构域，发现PC细胞比例升高而IC细胞比例降低（图5 C、G），Pax8rtTA/TRENICD小鼠转录组数据反卷积分析到的相似的结果（图5 D），这些数据表明Notch受体的表达和信号通路驱动成年肾收集管中IC-PC的转化。

在肾病患者和动物模型中已经报道了Notch表达增加，作者分析了疾病状态是否改变了PC和IC细胞的相对数量。叶酸（FA）诱导的慢性肾病小鼠模型中发现IC和PC细胞的典型交替模式丧失。与未处理的小鼠相比，PC细胞增加且IC细胞减少（图5 E、G）。通过对FA肾病模型和对照组的RNA测序进行反卷积分析，得到了一致的结果（图5 F）。在91例肾病活检样本中，疾病样本中PC细胞比例更多，Hes1表达更高（图5 H）。

IC细胞专门表达H⁺转运基因，因此与肾脏的酸分泌相关。当编码酸转运的基因（例如ATP6V1B1）发生突变后会引起代谢性酸中毒，作者发现FA诱导的小鼠肾脏疾病模型中，总血液CO₂水平（血清碳酸氢盐和pCO2）显著降低，与代谢性酸中毒症状一致（图5 I）。这些数据表明：1、IC向PC转换由Notch配体（IC）和受体（PC）表达介导；2、向PC细胞的转变是小鼠模型和CKD患者代谢性酸中毒的可能原因。

图5

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